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广东省人民医院 李安娜编译 这是一项来自于新加坡国立癌症研究中心的研究；该研究主要目的是检测MET基因拷贝数（CNG）对未经治疗的EGFR突变阳性非小细胞肺癌的影响。这项研究是目前为止最大的针对未经TKI治疗的EGFR突变非小细胞肺癌合并MET 拷贝的研究，研究发现MET 拷贝数不能反应对EGFR治疗的疗效。 前言 MET作为一种原癌驱动基因及潜在的治疗靶点，目前熟知的异常包括MET 14外显子的跳读和基因拷贝数的增加。在EGFR突变的非小细胞肺癌患者中，MET基因拷贝数最初被发现为获得性耐药的机制。随后，多项研究探讨了联合MET及EGFR TKI克服耐药方面的作用；但是，迄今为止，研究结果显示对针对MET高表达的病人，联合治疗的效果并不如意，目前也尚无明确的MET阳性的定义。个案报道发现EGFR突变合并MET扩增对厄罗替尼原发耐药的非小细胞肺癌患者，在联合克唑替尼治疗后肿瘤快速缩小，提示着MET其实又是一个真正的靶点。 过去大多数针对获得性耐药的研究，通常采用FISH标准去定义MET成瘾性肿瘤。这些方法包括：通过每个细胞MET信号的绝对数（例如CNG）的计数法（范围：2-6），MET/CEP7的比值，通过比值来区别是MET扩增还是多倍体（如图2）。不像其它的驱动基因，MET的复杂性在于，MET CNG经常和其它驱动基因例如EGFR、ALK以及KRAS并存。
未经TKI治疗的转移性EGFR突变肺癌的MET拷贝发生率的数据很少，最近来自MSK的研究报道了通过NGS确认MET扩增比例约2%，其与FISH的相关性尚不清楚。该研究通过FISH检测EGFR突变阳性患者合并MET CNG的临床特征及流行情况，假设MET 高拷贝的患者具有MET活性并且会抑制对TKI的反应。分析MET在早期肺癌的瘤内异质性，探索NGS与MET FISH之间的关系，强调克隆性的MET扩增是MET抑制剂有效的真正靶点。 研究设计与方法 该研究采用了二个队列: 第一队列:回顾性收集2014.9-2016.9 200例EGFR突变并且知道MET FISH状态的转移性肺腺癌的患者，EGFR突变采用Sanger测序或者Cobas（ROCHE）。 总共筛选了200例患者MET 高拷贝及MET 低拷贝表达队列的临床特征，154例患者可评价一线EGFR TKI的疗效。TTF为首要研究终点；TTF分析时间为2017年4月7日，为了评估MET状态，第二次分析截止时间为2017年10月3日，在154例中37例出现进展并进行了再次活检。 第二队列:分析了13例早期、EGFR突变、手术切除患者的MET异质性。总共59个空间区域评估MET CNG 的状态，并通过亚群检测MET FISH与NGS的相关性。 FISH判读：在选定区域从100个非重叠信号的核心数MET和CEP7的拷贝数，MET拷贝数≥5个信号为高表达，MET/CEP7≥2为扩增。MET CNG≥5但MET/CEP7≤2定位为多倍体。在MET 高拷贝或扩增患者中评估MET的空间异质性。 原代细胞培养：A482细胞来自于一位原发EGFR TKI耐药患者，分离出19个克隆。 NGS检测：采用161个肿瘤基因的Oncomine Comprehensive Panel version 3。
结果：
发现MET 高拷贝的比例为26%（52/200）；其中23%(46/200）是多倍体，只有3%（6/200）是扩增；这些病人中，59.6% MET CNG 是6-8之间，只有21.1%是大等于8。对于MET扩增的患者，中位CNG是7.6（6.4-10.1），中位MET/CEP比值是2.3（2.0-4.5），
MET 高拷贝与MET 低拷贝的患者临床特征是相似的，包括年龄、性别、吸烟状态，脑转移状态以及EGFR的突变。在MET 高拷贝的患者中，39例接受了EGFR TKI治疗，其中69.2% (27/39)的患者接受了一线EGFR TKI的治疗，30.8%（12/39）的患者接受了二代TKI的治疗，在115低MET表达的患者，接受一代EGFR TKI为73例，二代EGFR TKI为42。
一线TKI治疗的结果：
中位随访9.6个月（0.1-29.9月），无论MET CNG的高低，中位TTF是相似的；MET 高拷贝TTF为12.2个月（95%CI 5.7-22.6月），低MET-CNG为 13.1个月（95%CI 10.6-15.0月），RR发别为74.4%和53.9%，提示MET-CNG≤5并不预示着更差的生存（P=0.033），另外，以平均CNG 6.8分层分析发现RR或TTF仍然没有差异。只在5例MET扩增患者上发现生存更短（中位TTF 5月，1.0-6.4月）。
进展后的再活检及MET状态的改变：
在第二次截止随访日期，74.3（29/39）患者判定为MET 高拷贝，75.6（87/115）判定为低MET拷贝。一线EGFR TKI进展后，37例患者接受了再活检，23例检测了MET状态。17%（4/23)是高MET拷贝，这和之前报道的TKI耐药后的MET发生率相似。在基线时有6例MET高表达的患者，在进展后MET是低表达的。相反的是，17例中16例基线MET低拷贝的患者再活检MET仍然是低拷贝。综上，提示在未经治疗的EGFR突变阳性的非小细胞肺癌中，高拷贝MET在开始状态的亚克隆并不是驱动基因。
MET CNG在早期肿瘤的瘤内异质性：
为了研究未经治疗的EGFR突变阳性非小细胞肺癌手术切除的不同区域MET表达，研究采用外显子测序数据并涵盖了SNP阵列评估MET CNG系统发育树。发现53.8%（7/13)肿瘤显示至少有一个区域出现MET CNG ，这七个肿瘤中有六个部分的MET CNG存在差异，证实了MET的高度异质性。同样，在85%（11例）和77%（10例）的肿瘤中发现至少一个部分的EGFR和HER2 GCN和发育树相关，11例肿瘤中的8例和10例肿瘤中4例的拷贝数在肿瘤内发生了变化。 通过对每个切除样本进行FISH检测来确认上述发现（12/13)，采用成对镜像组织和图像，3例发现MET的多倍体，再次证实瘤内MET的异质性；相比这下，校正为MET/CEP7的比值显示变异较小，每个部分的一致性得到改善，提示比值法是一种更强的量化指标。因此认为，基因特异性的拷贝是可以随机发生的，肿瘤进展基因不稳定性可能是持续的，因此需要更多的精准的方法来确认。
克隆性MET扩增作为原发EGFR TKI耐药的机制：
研究进一步发现活化的MET拷贝是原发EGFR TKI耐药或者反应比较差的原因。8例对一线EGFR TKI治疗疗效小于6个月的患者，2例是高拷贝的，其中1例是MET扩增。这例患者是一位62岁非吸烟女性，合并EGFR L858R突变以及共存MET扩增（拷贝数7.3，比值3.4，ROS1/ALK阴性），厄罗替尼治疗4周后疾病进展，由于无法耐受双药联合的负反应，患者选用克唑替尼每隔一天单药，病灶明显缩小，于是认为她是MET驱动的EGFR突变的肺癌。
成功分离了这位患者的细胞（A482），共收集了19个带有EGFR L858R突变单细胞克隆，MET中位拷贝数是4.8，提示了MET CNG克隆和树干的EGFR突变是并存的，也预示着对EGFR TKI治疗反应的应答不良。
克隆性MET FISH多倍体或扩增：
检测空间MET/CEP7比值在单个细胞及区域之间存在可见的克隆性，在队列1中，检测了所有被确定为有效组织（n=5/6）MET扩增患者的MET/CEP7比值的空间分布，并与5例MET手术切除标本进行比较。发现2例具有最高比值的患者（SN5687及SN5388)TTF最短，分别为的 0.5月和1.0月；提示空间异质性小可能是EGFR TKI原发耐药的原因。
NGS和MET 高拷贝的相关性：
最后，该研究评估拷贝数及NGS之间的相关性，18/39例患者评估为MET高拷贝（2例扩增，16例多倍体）有足够的组织，只有8/18可以检测NGS。在2例MET扩增的患者中（3.4和2）, NGS并没有相应的MET扩增，另外，在CNG大等于8的肿瘤中只有1/3能检测到NGS扩增，这项研究结果提示，MET FISH和NGS的相关是非常低的；也提示了不同队列收集的影响（测序的阅读对比荧光信号）以及材料的输入（单个以及富集的DNA多个区域）。
讨论：
发现通过FISH确诊的MET扩增比例比预计的高，合并MET高拷贝并不显著影响EGFRTKI的疗效，这可以部分解释为多区域测序展示的亚克隆事件。另外，在耐药前后对比的标本检测中，3/6例患者MET高拷贝丢失了，这表明，EGFR-TKI所施加的选择压力并没有持续增加MET的高拷贝，可能是因为仅由≥5定义的MET功能模棱两可。然而，之前报道的MET抑制剂，包括文章中展现的对克唑替尼有效的病例，确认了对EGFR突变阳性的非小细胞肺癌MET仍然是一个可选择的靶点， 高精准的生物标记物仍然是靶向治疗最大效率化的基石，既往报道的MET CNG的未经治疗的EGFR人群中发生率为1.4-20.7%，反应了不同分期，EGFR突变状态，种族，不同平台以及MET阳性定义的不同。既往的MET相关临床试验是失败的，该研究提示即使选择更高的MET拷贝数，例如拷贝数≥5，也不一定和临床上基因驱动与否相关，尤其是合并其它驱动基因的时候。进一步采用高阈值，以及搞清瘤内异质性，高振幅拷贝数改变是晚期的个体化事件。MET克隆的随机性选择限制了基线 MET的预测效果，要更进一步提高预测指标，比如通过FISH确认的特殊的空间异质性，能进一步提高患者的选择性。 至于肿瘤的纯度，测序的参数，空间异质性都对FISH与NGS之间的关系有影响，提示了多种确认手段的重要性。总之，这项研究是目前为止最大的未经TKI治疗的EGFR突变非小细胞肺癌合并MET FISH的研究，MET 拷贝数不能反应对EGFR治疗的疗效，这可能是由于瘤内的异质性以及MET阈值定义不清，阐明选择参数和进一步确定何种患者将从MET抑制剂中获益非常重要。
参考文献：Lai Gillianne G Y,Lim Tse Hui,Lim John et al. Clonal MET Amplification as a Determinant of Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance in Epidermal Growth Factor Receptor-Mutant Non-Small-Cell Lung Cancer.[J] .J. Clin. Oncol., 2019, 37: 876-884.
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