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编译 广东省肺癌研究所 郑媚美
2023年世界肺癌大会第三天在Education Session：Tumor Biology - Translational Biology专场，来自UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center的Prof. Trever Bivona进行题为“Targeting Drug Tolerant Persister Cells and Residual Disease”的lecture，提出经TKI治疗后肿瘤无法完全被清除（incomplete response）、留有残余现象（residual disease，RD）背后的生物学机制，为寻找潜在干预靶点、增强靶向治疗清除肿瘤能力提供理论基础。
进展前未被靶向治疗完全清除的肿瘤细胞称为药物耐受性残余细胞（drug tolerant persister cell），对此Prof. Bivona提出两个关键挑战：一是寻找该特殊临床状态下的生物学标志物进行临床监测及干预；二是其机制，即这部分残余肿瘤是如何在持续性治疗下顽固地存活直至疾病进展、表现出肿瘤异质性。对此Prof. Bivona采用动态临床样本及临床前模型，分别从肿瘤细胞的基因组和转录组改变及肿瘤微环境的改变两个方面进行探索。
较早以前Prof. Bivona开展一项研究纳入50例晚期非小细胞肺癌患者，分别采集治疗前、治疗期间不完全反应及耐药时三个时间点的样本行单细胞测序。其中治疗期间不完全反应状态下的肿瘤即为本研究关注的残余肿瘤（RD）。
在肿瘤微环境层面发现，与治疗前或进展后的肿瘤相比，残余肿瘤表现出炎症通路的激活、更高比例的效应T细胞及较低比例的免疫抑制性巨噬细胞，呈现”hot micro-environment”的状态；相反治疗前及进展的肿瘤微环境为免疫抑制性特征（cold）。这提示从微环境层面寻找潜在的免疫位点、克服残余肿瘤持续存活的可能。
在肿瘤细胞层面，既往的研究提示在上皮细胞肿瘤发现细胞可塑性可能是耐药及肿瘤进化的原因，而本研究同样在临床单细胞测序的分析中发现残余肺腺癌细胞表达和肺泡细胞分化相关的基因，包括SFTPC、SFTPB、SFTPD、PDC、CLDN1B、ADR4等，具有AT1/2或祖细胞样特征；和正常组织、治疗前及耐药后肿瘤相比，残余肿瘤可见肺泡细胞signature表达显著上调。
通过临床单细胞测序分析还发现残余肿瘤细胞显著上调WNT/β-catenin通路，进一步采用包括新辅助临床研究的样本验证β-catenin、核CTNNB1等在残余肿瘤表达显著增加。
单细胞测序还发现肿瘤细胞在转录组层面显著表达YAP signature及相关的基因，包括GAS6、EPAS1、BMP4、PHILDB2、TNNC1、CD55等，免疫组化同样可见相比于治疗前，治疗后的残余肿瘤细胞核高表达YAP蛋白。
因此残余肿瘤的存活的机制可能并非单一，包括上述的细胞可塑性变化、WNT/β-catenin通路及YAP蛋白的活化等。
因而研究进一步采用临床前模型，在PDX模型行奥希替尼或者阿来替尼的治疗诱导出残余肿瘤状态。
残余肿瘤临床前模型从多层面验证在靶向治疗过程中YAP蛋白的活化促进药物耐受性残余细胞的存活，包括奥希替尼持续治疗诱导过程中YAP蛋白表达不断升高（WB），在EGFR、ALK、KRAS G12C、NF1等突变的模型均呈现一致的结果；而YAP基因敲除或抑制剂可以显著降低残余肿瘤细胞数量；GSEA分析发现YAPSSA基因表达显著上调。
Prof. Bivona同时构建和患者分子特征一致性较高的PDO模型进行药物诱导残余肿瘤状态，同样也发现YAPSSA基因表达显著上调。
既往在其它癌种发现focal adhesion kinase signature调节YAP的表达，在多株肺癌模型，和DMSO或者诱导阶段的肿瘤对比，残余肿瘤均检测到focal adhesion kinase signature的显著上调。抑制或敲除FAK家族可下调细胞内尤其是细胞核YAP的表达（WB），从而减少残余肿瘤细胞。因此这个实验结果揭示了YAP上游调控的机制。
基于此，FAK抑制剂VS-4718或者YAP抑制剂VT104联合原有的TKI或许可能有效控制残余肿瘤，延缓耐药的发生，Prof. Bivona团队正在和生物公司合作尝试开发该治疗策略的可能，初步数据可以看到EGFR L858R突变小鼠采用奥希替尼联合YAP抑制剂VT104具有显著缩瘤的作用。
接下来Prof. Bivona提出假说：和残余肿瘤相关的细胞可塑性变化、WNT/β-catenin通路及YAP蛋白的活化等机制之间可能相互关联。实验证明经典WNT通路蛋白包括β-catenin、WNT3A、WNT4、AXIN2、GSK3β和YAP蛋白同时上调，CO-IP实验证明β-catenin和YAP蛋白相互影响，而且这种残余肿瘤的促进作用通过washout实验是可逆的。
接着通过基因silencing编辑，发现同时敲除CTNNB1和YAP可显著下调AT1/2signature相关基因的表达（qPCR）包括AGER、IGFBP2等。因此以上实验建立起WNT/β-catenin通路和YAP蛋白之间相互影响、且两者共同促进细胞可塑性变化的关联。
采用药物干预β-catenin信号通路包括Tankyrase1/2抑制剂（XAV-939）、β-catenin/Tcf抑制剂（ICRT14）、β-catenin和CBP interaction阻断剂（PRI-724）可显著阻碍残余肿瘤细胞的生长。该结果在EGFR、ALK模型均得到证实。
基于以上研究结果提出靶向治疗过程中肿瘤细胞残余的潜在机制假说：转录组层面多条通路包括FAK家族、WNT/β-catenin、YAP等的激活促进AT1/2的改变，从而改变肿瘤细胞表型出现耐药。
在适应性突变（基因组层面）导致药物耐药的过程中，APOBE突变可能也是潜在的机制，这部分研究内容是Prof. Bivona和Charles Swanton团队合作的研究结果，本次lecture未展开阐述。
因此靶向治疗的耐药机制较为复杂，本研究首先采用临床样本的高精度测序发现在转录组层面，治疗期间顽固性残余肿瘤可能发生AT1/2分化改变、激活YAP蛋白及WNT/β-catenin通路等多种机制，接着采用临床前模型包括PDX和PDO进一步阐明YAP的上游调控机制，同时建立起上述几条通路之间的联系：FAK家族蛋白调控YAP表达，YAP和WNT/β-catenin相互影响，共同促进AT1/2分化的细胞可塑性特征。通过干预FAK家族蛋白、YAP蛋白或WNT/β-catenin通路可有效缩小治疗后肿瘤的残余，显著延缓肿瘤耐药，该治疗策略已进入开发阶段。然而肿瘤的耐药机制并非仅有单一层面，该研究团队进一步从基因组层面发现APOBEC家族突变也是促进肿瘤发生适应性反应的机制。总而揭示残余肿瘤的存活机制并相对应地开发克服耐药的治疗策略将有效延缓进展发生，从而延长患者生存。
参考文献：
[1] Maynard A, et al. Therapy-Induced Evolution of Human Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing. Cell. 2020 Sep 3;182(5):1232-1251.e22.
[2] Franziska Haderk, Celia Fernández-Méndez, Lauren Čech, et al. A focal adhesion kinase-YAP signaling axis drives drug tolerant persister cells and residual disease in lung cancer. https://www. biorxiv.org/content/10.1101/ 2021.10.23.465573v1
[3] Manasi K. Mayekar, Deborah R. Caswell, Natalie I. Vokes, et al. Targeted cancer therapy induces APOBEC fuelling the evolution of drug resistance. https://www.biorxiv.org/content /10.1101/2020.12.18.423280v4
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