地塞米松会抵消GBM患者使用免疫检查点阻断剂的疗效

编译：广东省肺癌研究所 陈旻星

介绍
免疫检查点抑制剂，如PD-1，已经改变了许多癌症的治疗方法，然而一些肿瘤，如胶质母细胞瘤 (GBM)对免疫治疗反应较差（checkmate-143与checkmate-498）。这些令人失望的结果可能反映了GBM的免疫抑制的多方面机制。外源性皮质醇可以限制免疫疗法（例如抗PD-1 和抗PD-L1）的治疗效果。同样，新诊断GBM的患者在使用地塞米松后接种新抗原不能产生免疫反应，而未接种地塞米松的患者则对多种接种的新表位肽产生免疫反应 (9)。
许多脑癌患者接受地塞米松治疗来治疗肿瘤或放疗产生的症状性脑水肿(10)。地塞米松，一种强效类固醇，是首选药物，因为其效力强、半衰期长和血脑屏障穿透性。地塞米松对免疫功能和对PD-1治疗反应的影响的具体机理尚不明确。
在此，我们评估了地塞米松对PD-1抑制剂治疗效果的影响，对象是免疫治疗敏感的GL261GBM肿瘤小鼠模型和免疫治疗抵抗的CT-2A肿瘤小鼠模型。还将研究地塞米松如何影响肿瘤内和全身免疫细胞群和功能。此外，我们评估使用地塞米松如何影响181 例使用PD-1(PD-L1)抑制剂的野生型异柠檬酸脱氢酶 (IDH)GBM患者的生存结果。


方法
细胞系、抗体和试剂
磷酸地塞米松用生理盐水稀释并按剂量腹腔注射。
颅内肿瘤细胞接种
GL261细胞或CT-2A细胞三围定位注入小鼠的右侧纹状体。
体内治疗和肿瘤评估
对于所有研究，肿瘤负荷增大的小鼠被随机分为对照组和治疗组。通过量化生物发光进行肿瘤评估。治疗性抗PD-1组和同种型对照是从术后第 6 天开始通过腹膜内注射给药。使用两种给药方案。大剂量方案，包括第一天负荷剂量（500 mg序贯每3天（250 毫克/剂），共注射6至8次，用于评估地塞米松对最大抗PD-1治疗获益的影响。一个减缩方案，仅包括四剂（每 3 天 250 毫克/剂）且没有负荷剂量，也用于实验抗 PD-1 的治疗效果降低时，使用地塞米松对治疗的影响。对照动物根据相同的给药方案接受等效剂量的同种型鼠 IgG。地塞米松作为单一药物以 10 mg/kg/天腹膜内注射，或与 PD-1一起以低剂量（1 和 2.5mg/kg/天）或高剂量（10 mg/kg/天）注射。在肿瘤植入第 27 天后不进行任何治疗。
接下来，我们评估了地塞米松给药的时机是否会影响免疫治疗效果。在这些实验中，第6天开始，每3天给PD-1抑制剂一次，共27天，共8剂；或在第 1-5 天给予地塞米松（10 mg/kg/天）。我们也评估在GL261和CT-2A肿瘤中的免疫治疗同步分割放疗中加入地塞米松的影响。每只小鼠接受的总放射剂量为10 Gy，（连续 5 天每天2 Gy）。地塞米松（10 mg/kg）在 GL261研究的第6-16天给药和CT-2A组的第6-27天给药。
我们还做了用于评估免疫记忆的再挑战实验，GL261细胞被注射到一组先前接受过治疗并存活超过100 天的小鼠的对侧大脑半球。将类似的肿瘤细胞接种物施用于未经治疗的小鼠作为对照。不做额外的治疗。
流式细胞术测定免疫变化进行免疫反应评估研究。通过流式细胞术分析全面分析免疫微环境，包括整个荷瘤大脑，颈部浅表淋巴结 (cLN)、脾脏和胸腺，使用酶解和机械进行组织分解。脑组织被去除髓鞘磷脂并分离白细胞。样品进行抗体组染色并通过流式细胞术完全计数。
为了评估 IFNg 表达，根据制造商的说明进行细胞内细胞因子染色。此外，我们将测量脾淋巴群的晚期凋亡，分别在第一次地塞米松给药1小时后安乐死或给药六次后安乐死的小鼠中测量（开始使用地塞米松后 121 小时），包括每日低剂量 (1 mg/kg) 或高剂量 (10 mg/kg)腹腔内地塞米松给药和IgG治疗对照组比较。
临床队列为了评估地塞米松的临床影响，我们回顾性地分析之前确诊的GBM患者，在DFCI（马萨诸塞州波士顿）接受评估并获得抗PD-(L)1治疗（正式临床试验或安慰剂）。在这些患者中， (i) 肿瘤在综合组织分子诊断为IDH野生型GBM，WHO4级。从患者的增强核磁共振中手动选择和测量感兴趣的肿瘤体积数据。使用 Kaplan-Meier 方法估计OS。进行多变量Cox 回归分析以调整OS，变量包括163名具有完整注释数据的患者的诊断年龄和MGMT启动子甲基化状态，以及当时的以下情况：疾病状态（新诊断 vs. 复发性），karnofsky量表（KPS；≤70vs. 80 vs. ≥90），肿瘤体积，以及是否进行了抗PD-(L)1 治疗前的大体全切除 (GTR)。


结果小鼠模型中同时使用地塞米松会限制抗PD-1治疗以及放疗的生存获益

我们首先评估了地塞米松剂量和给药时机对PD-1阻断剂的抗肿瘤活性的影响。在地塞米松给药同时给予低剂量(1 或 2.5 mg/kg) 或高剂量(10 mg/kg)大剂量型抗PD-1 治疗，结果如图1A。


71.4%的小鼠颅内的GL261肿瘤在单一使用抗PD-1治疗时被有效治愈（图 1B）。

相反，在抗 PD-1 治疗的同时接受地塞米松的小鼠中，OS以一种剂量依赖的方式下降，这在高地塞米松剂量下最为明显。OS在100天分别为，1mg/kg地塞米松组47.1%(P = 0.04),2.5mg/kg地塞米松组 31.3% (P = 0.008) 和 10mg/kg地塞米松组26.5% (P < 0.001)。单独用地塞米松治疗的小鼠与用IgG (P = 0.31)的对照组OS类似。通过生物发光（图1C；和MRI（图1D）证实了肿瘤负荷的变化。

长期存活（即≥100 天）的动物被进行再挑战实验。GL261转导细胞植入对侧大脑半球。在仅接受抗 PD-1 治疗或抗 PD-1 联合1或 10mg/kg 的地塞米松同时使用三个组中，分别有85.7% (6/7)、100% (5/5) 和 75.0% (3/4)成功清除肿瘤并存活至少 128 天（P = 0.57）。所有先前未治疗小鼠接受再挑战均死亡（中位OS，27 天）。
然后，我们评估了在第1-5天使用地塞米松，并在第 6 天开始抗 PD-1 治疗，在抗PD-1 治疗期间停药。与同时用药对比，地塞米松在抗PD-1治疗之前给药不会改变生存率（P = 0.64）
其次，放射治疗是GBM患者的标准疗法，我们评估了同时使用地塞米松对OS的影响。开始时使用抗 PD-1的剂量密集计划（图 2A）。使用这个时计划，75.0% 接受抗 PD-1 单药治疗的小鼠长期存活（即，≥100 天）。正如所料，地塞米松的加入显着降低抗 PD-1 治疗的中位 OS 获益，从>100天至 30 天，P = 0.049] 并将长期存活率降低了一半。

使用放射治疗，中位 OS 适度延长（与同种型对照相比（42 天对29天，P = 0.001）。然而，同时使用地塞米松治疗与单独抗 PD-1 或加放射治疗的对比显示出长期生存的下降趋势，但未达到统计显着性（P = 0.15）。
使用减缩的抗PD-1给药方案（图2B），地塞米松与抗 PD-1单药治疗的同时使用长期OS率从 37.5%讲至 12.5%（P = 0.04）。OS从单纯放疗的37天增加到放疗加抗 PD-1的66 天，虽然总OS没有达到显着性（P = 0.25）。然而，当地塞米松添加到抗 PD-1放疗联合使用时，生存率下降至单独放疗的水平38天（P=0.78），表明地塞米松抵消了治疗抗 PD-1 的益处。

然后我们使用 CT-2A模型重复了这个实验，已知其对抗 PD-1 的反应低于 GL261，使用剂量密集型抗 PD-1 方案（图 2C）。与对照组相比中，抗 PD-1 表现出统计学上显着的 OS获益，长期幸存者率在25%（P < 0.001）。放疗也适度改善了OS [中位数为 39 天],而同种型对照中的 30 天(P < 0.001],抗PD-1联合放疗则达到了有限的附加益处。如同GL261模型，将地塞米松添加到联合治疗则显着降低OS（中位OS 31 天），而单药抗PD-1中位OS为34天)，而抗PD-1联合放疗中位OS为42天；P < 0.001）。地塞米松同样完全抵消抗PD-1单药治疗对 OS 的益处（添加地塞米松的风险系数：4.34；P < 0.002)。




地塞米松给药减少肿瘤内和全身免疫细胞群

为了研究使用地塞米松限制抗PD-1治疗的机制，我们使用了流式细胞计数来量化从颅内肿瘤、颈部淋巴结和脾脏中分离的特异性性和非特异性免疫细胞群。添加地塞米松（10 mg/kg）给药显着降低来自颈部淋巴结，脾，胸腺的 CD45+、CD3+、CD4+ 和 CD8+ 细胞的数量，而独立于抗 PD-1 治疗（图 3A和B)。

在一些脑肿瘤中的淋巴细胞 (TIL) 群体中也观察到了这些模式。地塞米松也减少CD8/CD4+细胞比率。CD8+、CD4+FOXP3 和 CD4+ FOXP3+ T 细胞的减少在肿瘤免疫微环境中也被观察到。
为了评估地塞米松对T细胞功能的影响，我们通过细胞内细胞因子染色测定离体刺激的脾T细胞中的 IFNg 细胞因子表达。使用地塞米松显着降低细胞IFNγ阳性的比例（图 3C）。

然后我们通过测定早期激活标志物CD69表达评估地塞米松对T细胞活化的影响。地塞米松，单独或与抗 PD-1使用，减少CD69+细胞数量（图3D）。

在固有免疫方面，地塞米松显着降低肿瘤内自然杀伤 (NK) 细胞，而其他髓系细胞群呈下降趋势，特别是将地塞米松添加到抗 PD-1中（图 3E 和 F）。同样，PD-L1+髓系细胞 (CD45 CD11b)、活化髓系细胞 (CD45 CD11bCD80+ CD86+) 和成熟树突细胞 (CD45+CD11c+ CD86+ CD80+)的下降在地塞米松给药时可被观察到（图3G）。


地塞米松诱导淋巴细胞凋亡

然后我们研究了地塞米松如何减少淋巴细胞水平。在使用地塞米松1小时后，脾脏CD4+ 和 CD8+ T细胞表达晚期凋亡标志物 (7-AAD+ Annexin-V+)的细胞数量已经增加(图 4A)。

继续使用地塞米松 6 天，晚期凋亡 CD8+ 和CD4+ T细胞的百分比在低剂量组保持稳定，高剂量组则显著增加（对于 CD8+ T细胞，P=0.005，对于CD4+T细胞，P=0.03）。地塞米松显着降低来自颈部淋巴及和脾脏的 Ki67+ CD4+ 和 CD8+ T 细胞的数量（图 4B）；

然而，地塞米松没有降低增殖T细胞的比例（图 4C）。这些数据表明地塞米松主要地通过诱导细胞凋亡减少T细胞数量。


地塞米松降低了接受抗PD-(L)1治疗GBM患者的调整生存率
为了了解地塞米松对临床抗PD-(L)1治疗的影响，我们分析181名IDH野生型GBM 患者的 OS，其中75.7% (n= 137) 为复发病例和24.3% (n=44) 为首次诊断。中位随访时长为 22.1 个月，其中153人（84.5%）已经死亡。基线地塞米松使用，每天<2 mg (n=29, 16.0%) 或每天≥2 mg (n=35,19.3%)，将未调整的中位OS降低至 8.1 个月（P < 0.001）和 6.3 个月（P = 0.001）（图5A），没有使用基线地塞米松的患者中位OS为13.1 个月。

基线地塞米松的灾难性效果在多变量分析中持续存在，我们调整了疾病诊断（新诊断与复发），年龄、MGMT 启动子甲基化状态、KPS、抗PD-(L)1治疗起始时候的肿瘤体积和切除范围（n=163；图 5B；）

基线地塞米松使用是确定的最强负面风险因子。即使在多变量调整后，基线地塞米松在低剂量（即每天<2 mg；HR=2.16；P =0.003）或更高剂量（即每天≥2 mg；HR=1.97；P = 0.005）都消除了生存获益。


讨论免疫检查点抑制剂改变了癌症的治疗。免疫检查点的免疫相关副作用通常用类固醇治疗，如泼尼松和甲泼尼龙。虽然一些研究表明，使用皮质类固醇不会影响治疗效果，其他研究表明它们可能会削弱疗效 (16, 17)。更多数据表明基线类固醇或在免疫检查点治疗的早期使用类固醇可能是有害的。例如，在接受免疫检查点阻断治疗的晚期非小细胞肺癌患者中，基线类固醇的使用预示着较差的生存结果。而在开始抗CTLA-4治疗后 7 周内接受皮质类固醇的晚期黑色素瘤患者，与在较晚的时间点使用类固醇治疗的患者相比，前者治疗结果更差，特别是在那些患有低突变负荷肿瘤的患者（5-7）。
原发性和转移性脑肿瘤患者通常长期使用地塞米松来治疗肿瘤或治疗因素引起的水肿。最近的多变量分析表明，类固醇的使导致GBM患者的生存率更差，这结果独立于其他的预后因素。机制仍有待澄清，但类固醇对免疫功能和抗肿瘤免疫的抑制可能是一个促成因素。GBM患者使用地塞米松后表现出明显的淋巴细胞减少。
为了更好地了解地塞米松对抗PD-(L)1治疗的影响，我们使用正常免疫活性GL261肿瘤 和 CT-2A肿瘤小鼠模型。我们小组和前人已经证明，GL261模型对抗 PD-1 治疗反应更良好，很可能是由于其固有的免疫原性和高肿瘤突变负担。GL261模型被认为为不能代表人类GBM肿瘤，人类GBM通常表现出低的免疫原性和突变负担，从而产生免疫学上的“冷”肿瘤微环境。尽管GL261模型的免疫原性更强，我们发现同时地塞米松限制了抗 PD-1 的治疗益处，即使在低剂量下。我们还注意到，地塞米松给药的时间也是相关的。地塞米松与抗PD-1同时给药在我们的小鼠 GBM 模型中对生存产生不利影响，而在开始抗 PD-1 之前给予地塞米松没有产生，虽然这种差异可能是由于地塞米松在小鼠体内半衰期短以及这个方案的地塞米松用量较少造成。此外，使用地塞米松的影响是剂量依赖性的，与低地塞米松剂量水平相比，高水平地塞米松组长期存活率减半。
因为放射治疗是 GBM治疗的基石，我们评估了同时使用地塞米松对生存的影响，使用类似于用于治疗人类的化疗时间表进行放射治疗。我们特意采用了延长辐射时间的计划，但无法治愈大多数荷瘤小鼠，这是典型的GBM患者放疗的情况。每天 2 Gy，持续 5 天，我们观察到对GL261和CT-2A组都有适度的生存获益。当地塞米松同时给药时，抗PD-1联合放疗生存率有下降趋势。值得注意的是，地塞米松似乎没有影响记忆 T 细胞的反应，
长期生存小鼠能够存活于肿瘤再挑战，无论小鼠是否接受过地塞米松。来自肿瘤和病毒的临床前研究发现尽管记忆 T 细胞对糖皮质激素诱导的细胞凋亡敏感，使用皮质类固醇，通过抑制关键的脂肪酸代谢途径，选择性地减少和削弱低亲和力但不是高亲和力的记忆 CD8+ T细胞。这些数据表明对于高免疫原性肿瘤，高亲和力抗肿瘤记忆细胞在有皮质类固醇诱导凋亡下仍可能持续存在。
然后，我们研究了抗 PD-1 中添加地塞米松为什么降低存活率。在我们的实验中，地塞米松显着降低肿瘤中、淋巴结、胸腺中CD3+ T淋巴细胞数量。我们的发现证实了最近的一项研究：GL261荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞会在使用地塞米松时减少。与其他肿瘤模型类似，我们观察到相同剂量的皮质类固醇对 T 细胞的影响取决于它们位于外周还是肿瘤内，外周通常表现出更多的淋巴凋亡。我们发现地塞米松导致的 T 细胞耗竭早在用药后1小时后开始，即使是相对较低剂量水平的地塞米松。这种效应在地塞米松使用开始后持续，并且随着反复使用较高的地塞米松剂量而增加。此外，我们研究了地塞米松对淋巴细胞增殖的影响，发现地塞米松减少了增殖性 T 细胞的绝对数量，而增殖T 细胞的比例没有下降。不同剂量和用药时机下，皮质类固醇对淋巴细胞增殖有不同程度的促进或抑制。此外，不同的免疫细胞类型和状态对地塞米松的敏感性不同例如，在人T细胞的体外培养中，地塞米松使幼稚 T 细胞的增殖受损，而记忆T细胞则没有。通过上调幼稚 T 细胞中CTLA-4 的表达。抑制CTLA-4，但不是 PD-1，能够部分恢复增殖功能。
除了对免疫细胞亚群的数量影响外，使用地塞米松也会影响免疫细胞功能。我们观察到地塞米松降低了脾CD4+和 CD8+T细胞产生 IFNγ的能力，同时减少CD4+ 和 CD8+ 细胞的数量表达CD69，一种早期激活因子。我们还评估了地塞米松对固有免疫影响，大多数髓系细胞和自然杀伤细胞显着减少，CD80+CD86+骨髓细胞和 DC也是如此。全面剖析免疫微环境，我们评估了整个荷瘤组织，因此它将肿瘤外免疫细胞包括在我们的分析中。然而，他们的作用预计影响有限，这是由于大脑独特的免疫生态，以淋巴细胞相对稀少、非小胶质髓系细胞为特征。
根据我们的研究结果，最近的一项研究利用GL261模型也证明了抗 PD-1 治疗联合地塞米松降低了生存率和长期生存率。然而， 抗PD-1给药之前、期间和之后，给予地塞米松给药在该研究中似乎没有影响生存。与我们的研究相反，一部分单独用地塞米松治疗的荷瘤小鼠仍然是长期幸存者，而我们的所有接受塞米松单药治疗的小鼠均死于进展性肿瘤，存活率类似于未经治疗的对照组。这可能是由于不同的抗 PD-1 抗体，不同给药方案，不同
的肿瘤细胞接种物和不同来源的地塞米松。
为了评估我们的临床前发现是否具有临床相关性，我们回顾性评估了在我们机构接受治疗的181名IDH 野生型GBM患者的生存结果。我们发现未服用地塞米松的患者OS优于使用地塞米松，与疾病的关键预后因素无关。除此之外，地塞米松的不利影响与地塞米松剂量无关：较低（<2 mg）和较高（≥2 mg）剂量均导致抗PD-(L)1治疗OS下降。然而，我们的分析无法评估不同剂量水平之间OS的差异，因为统计学效力不足。由于我们试验的回顾性和异质性，我们的结果需要在随机对照试验进行验证，但最近一项随机III期研究的分析表明使用nivolumab治疗复发性 GBM 患者，如果他们使用地塞米松，则生存率下降，这与我们的结果一致。该结果亦表明地塞米松影响了GBM患者的抗PD-1治疗疗效。我们的结果对正在或准备进行的一些评估GBM患者抗PD-1治疗临床实验很有意义，对其他肿瘤的脑转移治疗也很有意义，因为抗PD-1治疗跟激素都是常用治疗。


结论总之，我们证明在抗 PD-1 耐药模型CT-2A和抗PD-1敏感GL261模型中使用抗PD-1治疗同时使用地塞米松会消除治疗的生存获益，且剂量依赖。虽然GL261模型在细胞来源和组织病理学特征方面与人类GBM肿瘤类似，其显着的突变负荷和内在高免疫原性导致我们会高估抗PD-1治疗的获益。该模型对抗PD-1的高敏感性使地塞米松即使在相对较低的剂量下，也会明显减弱抗PD-1的治理效果。这些发现在我们其他实验中也得到了复制，使用更具临床相关性、具有免疫抗性的 CT-模型，使用地塞米松消除了PD-1单一疗法或抗-
PD-1联合放疗的疗效。一项研究表明地塞米松消除了Delta24-RGD溶瘤病毒相关的抗肿瘤作用和治疗益处，与我们的实验类似。我们进一步证明，同时使用地塞米松导致特异性和固有性免疫效应细胞的数量和质量/功能下降。淋巴细胞水平降低主要是由于细胞凋亡增加。地塞米松给药。在使用抗PD-1治疗IDH 野生型GBM患者中，我们证明基线使用地塞米松与较差的生存率相关，这独立于疾病设置、年龄、肿瘤大小、肿瘤切除情况，MGMT 启动子甲基化和患者的体能状态。我们的数据也支持老年 GBM 患者使用PD-1治疗的生存结果差于年轻患者。
总而言之，我们的结果进一步支持了类固醇可能对肿瘤患者的免疫治疗有害：地塞米松疗法，通常用于治疗GBM患者出现症状性脑水肿，限制了免疫检查点阻断剂的治疗效果。正在进行免疫治疗临床试验的神经肿瘤患者，使用地塞米松前需要仔细评估。我们的临床前分析也表明出现地塞米松的不利影响是剂量依赖性的，无法避免使用地塞米松的患者应尽可能使用最低剂量。评估替代方法治疗症状性脑水肿，例如抑制VEGF诱导的血管通透性增加，值得进一步研究，以限制接受免疫治疗的GBM患者的地塞米松暴露。

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