作者：肺癌前沿
编译：广东省肺癌研究所 陈旻星 吴莜 黄宸
近日，来自弗朗西斯•克里克研究所教授CharlesSwanton团队发表重要研究成果，揭示空气污染物促进肺癌发生发展的机制。
介绍
空气污染每年导致700万人死亡。细颗粒物是空气污染的关键组成部分，空气动力学当量直径小于等于2.5微米的颗粒物 (PM2.5)能够深入肺部，引起包括心脏病和肺癌在内的不良健康结果。
在既往研究中，对来自TRACERx 421队列的肺腺癌(LUAD)的分析显示，有吸烟史中的少数患者(8%)缺乏吸烟介导的突变证据，其中6.4%的患者有> 15年的烟龄，这一结果表明，吸烟可能通过其他机制促进癌症。
研究团队提出，空气污染物可能促进肺组织微环境的炎症变化导致预先存在的突变克隆扩增。将流行病学证据与功能性临床前模型和临床队列相结合，以破译空气污染诱导肺癌发生的潜在机制。
为了检验空气污染物与EGFR突变的肺癌发病率之间的关系，团队使用了几种生态相关分析,纳入来自三个国家或地区的数据，英格兰，韩国和我国台湾省。在3个国家或地区中，PM2.5水平和估计的EGFR驱动的肺癌发病率都有相关性。
为了在不限于EGFR突变病例的独立队列中探索3年累计PM2.5暴露量是否与肺癌相关，团队分析了英国生物数据库407,509名参与者的数据。一项包括所有参与者的分析表明，不论居住地点的变化，PM2.5水平与肺癌发病率相关(风险比(HR)= 1.08(95%置信区间:1.04-1.12)，原始P≤0.001，错误发现率(FDR) =0.001)。
细颗粒物介导肺癌发展
通过构建腺病毒-CMV–cre小鼠模型（ET鼠），来介导促癌EGFRL858R突变的发生。在EGFR诱导后，将小鼠暴露于相应生理剂量的细颗粒物或PBS中3周，并在诱导后10周评估肿瘤负担。在该模型对照组中，极少表达EGFR的肺上皮细胞在10周后扩张形成浸润前瘤变。而对暴露于细颗粒物后ET小鼠的分析显示，浸润前肿瘤的数量呈剂量依赖性增加。
此外，腺病毒-CMV- cre KrasG12D肺癌模型的增生细胞数量也有增加。这些数据表明细颗粒物可以促进Kras和EGFR突变LUAD模型肿瘤进展。
接下来探讨了PM促进EGFR突变肺癌发生的机制。克隆动力学的空间分析表明，EGFR突变细胞的扩增在细颗粒物暴露期间没有发生，但在PM暴露结束后的一段时间内表现出来(3周，P = 0.82;10周，P =0.013)。在PM暴露的ET小鼠中，生长成簇的EGFRL858R细胞的比例和这些簇中的细胞数量在10周时增加，但在3周时没有增加(图4)。这些数据表明，PM通过两种方式促进早期肿瘤的发生:通过增加具有形成肿瘤潜力的EGFR突变细胞的比例，以及增加这些早期病变内EGFR突变细胞的增殖率。
为了测试PM是否诱导DNA突变，我们对暴露于PM或PBS的ET小鼠的肿瘤进行了全基因组测序。我们没有观察到PM暴露小鼠肿瘤突变数量的增加(P = 0.30)。这一结果表明，短期暴露于PM不会增强突变性。团队制作了免疫缺陷小鼠模型。与ET小鼠相反，这些免疫缺陷小鼠在EGFRL858R诱导后暴露于PM，不会导致瘤变增加。这一结果表明，免疫系统是PM介导EGFR突变肺肿瘤发生所必需的.
分析rosa26小鼠(对照组：EGFR野生型)和携带EGFR突变的小鼠(ET小鼠)在暴露于细颗粒物24小时后，肺免疫系统对PM的急性髓系反应。在两个组中，均观察到间质巨噬细胞比例上调以及细胞上PD-L1表达的增加。
细颗粒物介导的AT2细胞重编程
为了探究PM暴露对早期肿瘤发生的影响，采用流式细胞术纯化肺上皮细胞，并对四组细胞进行RNA测序(RNA-seq):对照组（EGFR野生型）小鼠暴露于PM或PBS, ET小鼠暴露于PM或PBS。基因表达值的主成分(PC)分析表明,基因变异的19%由PM暴露引起P < 0.001)；38%的变异由EGFR突变引起（P < 0.001)。在ET小鼠中，PM暴露导致调节巨噬细胞募集的基因上调，包括白细胞介素-1β (IL-1β)、GM-CSF、CCL6和NF-κB的基因以及上皮来源的警报蛋白IL-33。
AT2细胞可能是肺腺癌的起源细胞。我们注意到细颗粒物暴露导致AT2前体细胞状态相关的基因上调。对bulk RNA测序表达数据进行反卷积，发现在暴露于PM的ET小鼠中，AT2祖细胞活化评分增加。这一结果表明，PM暴露后，EGFRL858R AT2细胞被转录重编程为这种祖细胞状态。
团队构建了一个类器官模型，暴露于PM的ET小鼠的EGFR野生型细胞没有显示出类器官形成效率的增加(OFE;P = 0.075)。相比之下， EGFRL858R+细胞显示出OFE增加(P= 0.025;图3 d)。为了验证AT2细胞是否被PM特异性地改变功能，我们从未诱导的ET小鼠和对照小鼠中纯化AT2细胞，暴露于PM后，在体外诱导重组。只有暴露于细颗粒物且EGFRL858R+的 AT2细胞的OFE有增加(P = 0.0043)。倒转EGFR突变诱导和PM暴露的时间顺序也会增加OFE。这些数据表明，在体内暴露于PM和诱导EGFRL858R驱动突变的组合增加了AT2细胞祖细胞功能。
PM诱导巨噬细胞产生IL-1β
从未暴露于PM的ET小鼠中分离出AT2细胞，体外诱导EGFRL858R表达，并与暴露于PM或PBS的巨噬细胞共同培养。暴露于细颗粒物的间质巨噬细胞和肺泡巨噬细胞均增加了EGFR突变AT2细胞的OFE(间质，P = 0.0095;肺泡，P = 0.0002)。这一结果表明，巨噬细胞是PM诱导炎症的关键介质。
为了测试IL-1β在PM增强腺癌形成中的作用，我们将EGFRL858R+鼠模型暴露于细颗粒物，同时应用IL-1β抗体以及对照抗体。在细颗粒物暴露期间使用抗IL-1β抗体治疗减弱EGFR驱动的肺腺癌形成(P = 0.034)。总的来说，这些数据表明细颗粒物暴露的巨噬细胞足以在EGFR突变AT2细胞中诱导祖细胞样状态。此外，巨噬细胞是IL-1β在PM反应中的关键来源，IL-1β信号通路是促进PM介导的EGFR突变肺腺癌所必需的。
健康肺中的致癌基因突变
肿瘤启动和发展的模式来源于携带致癌驱动突变的组织学上正常的细胞。
既往分析表明EGFRL858R致癌突变很罕见。使用ddPCR和duplex -seq，从肺癌患者的或其他器官癌症患者的非癌肺组织以及无癌个体中寻找EGFR驱动基因突变的证据。
挑选195名患者的非癌性肺组织，使用MiSeq分析，过滤掉了在肿瘤和非癌组织中发现相同突变的情况。在此过滤步骤后，195例患者中有38例(19%)在非癌性肺组织中存在EGFR突变，而这些突变在肿瘤组织中未被检测到。这些发现表明，EGFR驱动突变可以存在于组织学正常的肺组织中，即使这些突变可能并没有在肿瘤发生过程中被选择出来。
接下来，我们使用TRACERx队列研究非癌性组织中的致癌EGFR突变与暴露于环境污染之间是否存在关联。碳质沉着，由炭疽色素的存在确定，可作为暴露于环境空气污染的替代标记。我们在非癌性肺带有碳质沉着组织中，根据EGFR突变有无分成两组。尽管在非癌性组织中EGFR突变与碳质沉着病之间没有关联(P = 0.39)，碳质沉着病与EGFR驱动突变的变异等位基因频率(VAFs)增加有关(t检验P = 0.015;图12)。尽管碳质沉着病与多种环境因素相关，数据表明，污染物与激活致癌突变的频率无关，而是与EGFR突变克隆的扩增有关。
接下来，我们在另一组患者(n = 81)中使用独立的超深度测序平台研究了EGFR和KRAS中其他基因组位点是否存在驱动突变。使用Duplex-seq进行分析，它涵盖了更广泛的突变(EGFR外显子18、19、20和21,KRAS外显子2和3).对相应的肿瘤组织进行了Duplex-seq测序，以确认所识别的突变仅在健康组织样本中发现。根据Duplex-seq序列数据，81个样本中有13个(16%)存在EGFR驱动基因突变(E709X, G719X, T725M，外显子19缺失，R765X, R776X, L858R或L861X;图4d)，而81个样本中有43个(53%)含有KRAS驱动突变(G12X,G13X或Q61X;图4d)。与KRAS在吸烟者肺癌中普遍突变一致，吸烟者中KRAS突变频率和VAF显著高于EGFR突变和VAFs，此外，在四个在两种基因中都有致癌基因突变的患肺癌吸烟者中，KRAS高置信度突变的VAFs始终高于EGFR，表明KRAS突变可能比EGFR突变在长期吸烟者的健康肺组织中有更高的选择性。
讨论
在本研究中，团队探索了空气污染细颗粒物在促进肺癌发展的模式。细颗粒物可能通过炎症轴触发预先存在的突变肺细胞的发展来使肿瘤发生发展，这可能是可治疗的。
EGFR突变肺癌发病率的频率与PM2.5水平升高之间存在关联。时间分析表明，3年的PM2.5暴露可能足以增加患EGFR突变的肺癌的风险。团队分析了该研究的局限性：使用汇总数据而不是参与者水平的数据；与EGFR突变状态相关的变量，如女性性别、亚洲血统和腺癌，可能会干扰结论；小鼠模型在没有细颗粒物的情况下也会发生癌症，可能不能代表健康成年人中复杂的突变谱；没有纯化上皮细胞，特别是AT2细胞，它可能是肺肿瘤的来源。
当将分析限制在英国LUAD队列中时，正相关性仍然显著。这项研究表明，除了其他已知的内在和外在因素外，PM暴露也导致了EGFR突变肺癌的地理差异，了解这些因素如何相互作用将非常重要。
这些实验表明，肿瘤发生的一个关键驱动因素是临床可治疗的炎症轴。值得注意的是，在CANTOS试验中，针对细胞因子IL-1β的抗体canakinumab已被证明可以降低肺癌发病率。
我们的研究结果也表明，癌症发展的主要触发因素不仅是健康上皮细胞中不可避免的驱动突变，还有促进突变细胞扩增和祖细胞活性的内在和外在机制。
总之，我们的数据表明，正如之前提出的那样，空气污染物与肺癌之间存在机制和因果联系，并证实了关于早期肿瘤发展的研究结果，为限制城市地区颗粒物排放提供了指引。
参考文献：
Hill W, Lim EL, Weeden CE, et al. Lung adenocarcinoma promotion by air pollutants. Nature. 2023;616(7955):159-167. doi:10.1038/s41586-023-05874-3
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