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非小细胞肺癌分子诊断研究 •已发现众多影响治疗方案选择的基因变异。对肺癌标本进行这些变异的检测，对于识别潜在有效的靶向治疗以及避免可能无法提供临床获益的治疗至关重要。 •部分靶向治疗的选择方法包括预测性免疫组化分析（IHC），这与用于识别肿瘤类型和谱系的IHC研究不同。 •不应使用临床病理学特征来选择需要接受检测的患者。 •生物标志物检测对分子结果的利用和解读至关重要，其主要要素包括： ▸使用经适当认证的实验室，至少需具备临床实验室改进修正案（CLIA）认证资质 ▸了解所采用的方法学及其主要局限性 ▸了解特定检测方法检测的变异谱系（及未覆盖的变异） ▸了解肿瘤样本在检测前是否经过病理学复核及肿瘤富集处理（如显微切割、宏观切割） ▸了解检测实验室可接受的样本类型 ▸了解有效结果与无效结果的构成。已知致癌驱动基因的阳性结果被视为有效结果。而缺乏已知致癌驱动基因（包括仅显示“过客”变异的结果）可能被视为无效结果，具体取决于标本局限性和临床情况。特别需要注意的是，组织检测中与肿瘤细胞含量相关的技术问题，或循环肿瘤DNA（ctDNA）检测中与疾病负荷相关的问题，都是结果解读时需考量的因素。更多考虑事项将在后续章节详细说明。 •组织标本的获取与管理： ▸尽管肿瘤检测主要集中于使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，但是，越来越多的实验室开始接受其他标本类型，特别是未经FFPE方法处理的细胞病理学制备标本。尽管多个伴随诊断检测在获得FDA批准时，其批准的检测范围并未包含细胞蜡块检测，但当细胞蜡块是唯一或最佳材料时，强烈建议采用此类标本进行检测。 ▸当使用微创技术获取样本时，获得NSCLC组织生物标志物检测结果的一个主要局限性是：获取的组织可能不足以进行分子、生物标志物和组织学检测。因此，支气管镜医师和介入放射科医师应获取足够的组织以完成所有适当的检测。 ▸当组织样本量极少时，实验室应采用技术最大限度地保留组织用于生物标志物检测，包括针对小活检的专用组织学方案，例如“预先”切片用于诊断和预测性检测。外周血（血浆ctDNA）可作为替代样本。 •检测方法学 ▸针对每种分析物，以下列出了适当的可能检测方法学；然而，通常需考虑使用多种方法学： ◊二代测序（NGS）用于临床实验室。并非所有NGS检测方法都能检测所有类型的变异，因此熟悉单个检测方法或检测方法组合中可识别的变异类型非常重要。 -能够有效利用有限活检组织同时最大化诊断基因组信息的MGPT方法，最常基于NGS。NCCN认可目前许多用于完全基因分型NSCLC的基于NGS的检测方法，其检测基因数量超过了现行程序术语（CPT）编码约定所使用的50个基因的阈值；因此，使用＞50个基因的检测组合可能更符合这些建议的实际需求。单一检测或有限数量检测的组合均可适用。 -尽管MGPT方法是首选，但在某些临床情况下可能需要进行快速检测，并应通过MGPT进行后续随访。 ◊基于RNA的NGS可提高新型融合的检出率，可与基于DNA的NGS同步或序贯进行。若基于DNA的分子分析未识别出可识别的驱动基因，则建议进行基于RNA的检测。 -若通过单项检测或有限数量检测方法组合，至少识别出 NSCL-20 中列出的生物标志物，并尽可能同时识别新兴生物标志物（ NSCL-I ），则认为生物标志物检测已完成。不推荐采用序贯、单基因检测。基于生物标志物共现率低的阶梯式检测方法是可以接受的。 ◊实时聚合酶链式反应（PCR）可用于高度靶向的方式（靶向特定突变）。使用该技术时仅能评估检测方法所靶向的特定变异，必须考虑特定检测方法范围外存在未覆盖突变的可能性。 ◊任何用于检测除高度特异性变异子集以外的序列的方法（如NGS）均可能识别出意义未明变异（VUS）。任何归类为VUS的变异，即使其所在基因的其他变异具有临床可操作性，也不应作为选择靶向治疗的依据。 ◊可采用其他方法学，包括上文未列出的多重检测方法。 ◊荧光原位杂交（FISH）分析用于许多检测拷贝数、扩增和结构变异（如基因重排）的检测。在某些情况下，FISH对基因扩增事件具有更佳灵敏度。FISH检测可识别染色体易位，从而推断基因融合事件的存在。 •标本选择 ▸目前可使用基于组织和外周血的检测平台。 ▸使用组织样本进行检测需获取合适的样本。 ◊通过非小细胞肺癌肿瘤组织检测到的变异最直接归因于肿瘤。 ◊若检测因样本量不足而导致技术性失败，建议考虑替代检测方式或获取额外组织以完成全面的生物标志物检测。 ▸使用外周血检测（最常见的是基于血浆的ctDNA检测）可与组织检测联合使用，以实现推荐生物标志物的基因分型。 ◊许多（但并非全部）ctDNA检测采用基于NGS的技术。ctDNA检测的技术优势与局限性详见下文说明。 •分子分析靶点 ▸下述突变/变异通常以非重叠形式出现，但仍有约1%-3%的NSCLC可能携带同时存在的变异。 ▸EGFR（表皮生长因子受体）基因突变：EGFR是一种正常存在于上皮细胞表面的受体酪氨酸激酶，在多种人类恶性肿瘤中常出现过表达。 ◊EGFR中最常描述的突变（19号外显子缺失、21号外显子p.L858R点突变）与口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的治疗应答相关；不携带EGFR敏感性突变的肿瘤在任何治疗线数中均不应使用EGFR TKI治疗。 ◊当考虑对IB-IIIC期NSCLC采用TKI治疗时，应进行EGFR突变生物标志物检测。虽然使用手术切除标本进行检测在技术上可能更容易，但初始诊断活检标本也可用于此适应症的检测。 ◊许多较少观察到的EGFR变异（累计约占EGFR突变阳性NSCLC的10%，如21号外显子p.L861Q、18号外显子p.G719X和20号外显子p.S768I突变），也与某些EGFR TKI（如奥希替尼和阿法替尼）的治疗应答相关，应尽可能根据具体突变类型予以考量。 ◊EGFR p.T790M最常见于对第一、二代EGFR TKI产生应答后出现的耐药突变。对于以p.T790M为主要耐药机制且在使用第一或第二代TKI治疗后出现进展的患者，第三代TKI通常有效。 -若在未接受过EGFR TKI治疗的情况下检测到EGFR p.T790M，则需进行遗传咨询及可能的胚系多基因组合检测（MGPT）。胚系EGFR p.T790M的检出提示无论吸烟状态如何均具有肺癌高风险。 ◊EGFR 20号外显子（EGFRex20）突变（不包括EGFR p.T790M）是一组异质性突变，其中部分突变对靶向治疗有应答，需详细了解具体变异信息。 -大多数EGFRex20变异是不同类型的框内重复或插入突变。 ▪这些变异通常与对第一、二、三代EGFR TKI治疗缺乏应答相关，但存在少数例外情况：p.A763_Y764insFQEA与TKI治疗的敏感性相关、p.A763_Y764insLQEA可能与第一、三代TKI治疗的敏感性相关。 ▪EGFRex20插入/重复与针对EGFRex20事件的特定后续靶向治疗药物的应答相关。临床研究中最常见的EGFRex20插入/重复为insASV、insSVD和insNPH，但也包括了广泛的其他变异。目前尚无证据表明特定变异类型会影响此类靶向治疗的应答概率。 ▪由于部分EGFRex20突变对第一、三代抑制剂敏感或可能敏感，因此明确EGFRex20插入突变的具体序列仍然至关重要。某些检测方法仅能识别EGFRex20插入的存在而无法确定其具体序列，此时可能需要额外检测以进一步明确插入的具体信息来指导治疗选择。 ▪基于PCR的靶向EGFR突变检测方法对EGFRex20插入事件的检出率不足，因此优先采用基于NGS的检测策略。 ◊检测方法学：实时PCR和NGS是检测EGFR突变状态最常用的方法。 ▸ALK（间变性淋巴瘤激酶）基因融合：ALK是一种受体酪氨酸激酶，在NSCLC中可能发生重排，导致ALK激酶结构域调控失常和信号传导异常。 ◊ALK最常见的融合伴侣是棘皮动物微管相关蛋白样4（EML4），但也已鉴定出多种其他融合伴侣。 ◊当考虑对IB-IIIB期NSCLC采用TKI治疗时，应进行ALK基因融合生物标志物检测。虽然使用手术切除标本进行检测在技术上可能更容易，但初始诊断活检标本也可用于此适应症的检测。 ◊ALK基因融合的存在与口服ALK TKI的治疗应答相关。 ◊检测方法学：FISH断裂探针法是最早广泛应用的检测方法。IHC可作为有效筛查策略。经FDA批准的IHC可作为独立检测方法使用，无需FISH验证。多种NGS方法可检测ALK基因融合。靶向实时PCR检测适用于某些情况，但不太可能检测到新型伴侣融合。 ▸ROS1（ROS原癌基因1）基因融合：ROS1是一种受体酪氨酸激酶，在NSCLC中可能发生重排，导致ROS1激酶结构域调控失常和信号传导异常。 ◊ROS1存在多种融合伴侣，常见融合伴侣包括：CD74、SLC34A2、CCDC6和GOPC（FIG）。 ◊ROS1基因融合的存在与口服ROS1 TKI的治疗应答相关。 ◊检测方法学：可采用FISH断裂探针法；但该方法可能漏检FIG::ROS1变异。可采用IHC方法；但ROS1融合的IHC检测特异性较低，因此将ROS1 IHC作为筛查方法时，后续确认性检测是必要组成部分。多种NGS方法可检测ROS1基因融合，但基于DNA的NGS可能漏检ROS1基因融合。靶向实时PCR检测适用于某些情况，但该方法不太可能检测到新型伴侣融合。 ▸BRAF（B-Raf原癌基因）点突变：BRAF是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是经典MAPK通路的组成部分。BRAF激活突变导致MAPK通路信号传导失调。 ◊BRAF突变可见于NSCLC。导致第600位氨基酸改变的特定突变（最常见p.V600E，罕见p.V600K、p.V600D或其他改变）与口服BRAF和MEK抑制剂联合治疗的应答相关。 ◊需注意NSCLC中还可观察到BRAF的其他突变，目前这些突变对治疗选择的影响尚不明确。 ◊检测方法学：实时PCR和NGS是检测BRAF突变状态最常用的方法。虽然市售有抗BRAF p.V600E特异性单克隆抗体，且部分研究已检验了此方法，但仅应在经充分验证后方可使用。 ▸NRG1基因融合：NRG1是一种参与神经系统和心脏发育及稳态维持的表皮生长因子（EGF）。NRG1基因融合导致通过ERBB家族受体酪氨酸激酶通路的信号传导异常。 ◊NRG1基因融合的存在与HER2/HER3双特异性抗体的治疗应答相关。 ◊检测方法学：基于NGS的检测是发现NRG1基因融合的主要方法；基于RNA的NGS优于基于DNA的NGS，因为NRG1基因融合通常无法通过基于DNA的NGS检测到，原因是NRG1中的大内含子通常未包含在靶向基于DNA的NGS组合或全外显子测序中。IHC不适合检测NRG1基因融合。FISH检测需经NGS验证。 ▸KRAS（KRAS原癌基因）点突变：KRAS是一种具有内在GTP酶活性的G蛋白，其激活突变导致MAPK通路信号传导失调。 ◊KRAS突变最常见于第12号密码子，但在NSCLC中也可见其他突变。
◊与肿瘤无KRAS突变的患者相比，存在KRAS突变是生存期较差的预后指标。 ◊由于存在重叠的可靶向变异概率较低，已知KRAS激活突变的存在提示患者不太可能从进一步分子检测中获益。 ◊KRAS p.G12C突变与口服KRAS G12C抑制剂（专门针对该突变设计）的后续治疗应答相关。除KRAS p.G12C外，该类抑制剂对其他突变的有效性尚未经过前瞻性评估。 ◊检测方法学：NGS和实时PCR是检测KRAS突变状态最常用的方法。 ▸MET（间质-上皮转化）14号外显子（METex14）跳跃变异：HGF受体（c-MET）是一种受体酪氨酸激酶。NSCLC中可能出现导致14号外显子缺失的突变。METex14缺失会导致调控失常和信号传导异常。 ◊METex14跳读突变的存在与口服HGF受体TKI的治疗应答相关。 ◊多种分子变异均可导致METex14跳跃。 ◊检测方法学：基于NGS的检测是发现METex14跳跃事件的主要方法；基于RNA的NGS可能具有更高的检出率。IHC不适用于检测METex14跳跃。 ▸RET（转染重排）基因融合：RET是一种受体酪氨酸激酶，在NSCLC中可发生重排，导致RET激酶结构域调控失常和信号传导异常。 ◊常见融合伴侣为KIF5B、NCOA4和CCDC6，但也已发现多种其他融合伴侣。 ◊RET基因融合的存在与口服RET TKI的治疗应答相关（无论融合伴侣类型）。 ◊检测方法学：可采用FISH断裂探针法；但该方法可能漏检某些融合。靶向实时逆转录PCR检测适用于某些情况，但该方法不太可能检测到新型伴侣融合。基于NGS的方法学具有高特异性，就融合检测而言，基于RNA的NGS优于基于DNA的NGS。 ▸ERBB2（Erb-B2受体酪氨酸激酶2）/HER2基因突变：ERBB2编码HER2，是一种存在于正常上皮细胞表面的受体酪氨酸激酶，在多种人类恶性肿瘤中常出现过表达或突变。 ◊在多种肿瘤类型中已发现涉及ERBB2的一系列基因组变异，包括突变和扩增，以及其他较少见的变异。 ◊ERBB2突变最常见的是20号外显子插入/重复事件，较少见其他激活突变。 ◊ERBB2激活突变与抗HER2靶向治疗药物的应答相关。 -虽然某些突变已知为激活突变（包括胞外结构域突变（如p.S310X）及20号外显子插入/重复突变），但并非ERBB2中的所有单核苷酸或双核苷酸改变均为激活突变，也并非所有潜在激活突变均在关键试验中研究过。 -激活突变的定义正在不断演变。FDA批准的不同药物，其标签适应症所涵盖的突变类型可能不同：一种药物要求存在激活突变（未指定具体突变），而另两种药物则获批用于酪氨酸激酶结构域突变。 -对于致癌性或可能致癌性ERBB2（HER2）突变，请参考oncokb.org上的定义。 ◊检测方法学：虽然可采用靶向PCR技术检测ERBB2突变，但基于NGS的方法能最全面评估突变的多样性和谱系。 ▸HER2蛋白过表达：由ERBB2编码的HER2可在多种恶性肿瘤中过表达。 ◊目前尚无针对NSCLC中HER2染色使用的特异性IHC抗体克隆的推荐。 ◊抗HER2单克隆抗体/抗体-药物偶联物（ADC）治疗的评分标准目前基于最初应用于胃癌的标准，该标准采用与乳腺癌不同的评分体系，且对小活检标本和手术切除标本采用不同的评分标准。 ▸HGF（肝细胞生长因子）受体（c-MET）蛋白过表达：由MET基因编码的HGF受体（c-MET）是一种存在于正常上皮细胞表面的受体酪氨酸激酶，可在NSCLC中过表达。 ◊HGF受体（c-MET）蛋白高表达水平与特定ADC药物的治疗应答相关。 ◊HGF受体（c-MET）蛋白表达的评估不同于MET扩增和MET 14号外显子跳跃事件的评估。 ◊检测方法学：IHC是检测HGF受体（c-MET）蛋白表达的必要方法。 -SP44抗体克隆是目前唯一被证明能有效预测ADC治疗反应的检测试剂。 -使用FDA批准的SP44方法改良版或替代克隆的实验室，必须证明其与获批方法下的SP44具有可比性。 -阳性结果定义为≥50%的肿瘤细胞呈现3+染色。 -NGS、RT-PCR和FISH不适用于检测HGF受体（c-MET）蛋白表达。 ▸NTRK1/2/3（神经营养性受体酪氨酸激酶）基因融合 ◊NTRK1/2/3基因融合的存在与口服TRK抑制剂的治疗应答相关。 ◊NTRK1/2/3是酪氨酸受体激酶，在NSCLC及其他肿瘤类型中罕见重排，导致调控失常和信号传导异常。 ◊目前已发现多种融合伴侣。 ◊迄今为止，除不存在其他驱动变异外，尚未发现与这些融合相关的特异性临床病理学特征。 ◊NTRK1/2/3的点突变通常为非激活型，且尚未开展与靶向治疗相关的研究。 ◊检测方法学：多种方法学可用于检测NTRK1/2/3基因融合，包括FISH、IHC、PCR和NGS；可能出现假阴性结果。IHC方法会因某些组织的基线表达而变得复杂。FISH检测可能需要至少3组探针才能进行全面分析。NGS检测可发现广泛变异。基于DNA的NGS可能漏检NTRK1和NTRK3融合。 •PD-L1（程序性死亡配体1）：PD-L1是一种可表达于肿瘤细胞的共调节分子，并能抑制T细胞介导的细胞死亡。T细胞表达PD-1（一种负向调节因子），其可与包括PD-L1（CD274）或PD-L2（CD273）在内的配体结合。在PD-L1存在的情况下，T细胞活性受到抑制。 ▸免疫检查点抑制剂抗体可阻断PD-1与PD-L1的相互作用，从而增强内源性T细胞的抗肿瘤效应。 ▸PD-L1免疫组化（IHC）检测可用于识别最可能对一线抗PD-1/PD-L1治疗产生应答的疾病。 ◊目前已开发出多种抗体克隆用于PD-L1表达的IHC分析，虽然其中几种在染色强度和阳性细胞比例方面具有可比性，但有些则不然。 -阳性与阴性结果的判定标准取决于所使用的具体抗体、克隆及检测平台，而这些抗体、克隆和平台可能对每种免疫检查点抑制剂治疗都是独特的。多种不同PD-L1检测方法的获批已引起病理医师和肿瘤医师的共同关注。 -尽管多项PD-L1 IHC克隆已获FDA批准用于特定适应症，但只要任何单个IHC检测方法在分类结果方面，已通过内部验证，确认与FDA批准的克隆具有可比性，则不常规推荐使用多种IHC检测方法。 -在NSCLC中，PD-L1 IHC的判读通常聚焦于任何强度下显示膜染色的肿瘤细胞比例，因此是一个线性变量；在其他肿瘤类型中，评分系统可能不同。 ◊虽然携带致癌驱动基因的患者可能出现PD-L1表达升高，但针对特定致癌驱动基因的靶向治疗应优先于免疫检查点抑制剂治疗。 •循环肿瘤DNA（ctDNA）检测： ▸部分实验室提供通过检测外周循环（最常见于处理后的血浆）中的核酸来识别分子变异的检测服务。 ▸ctDNA检测不应替代组织学组织诊断。 ▸除晚期/转移性疾病外，不常规推荐ctDNA检测。对于I-III期患者，首选基于组织的检测。对于局限于胸部的转移性疾病，组织分子检测可能具有更高的检出率。 ▸研究证实，ctDNA与组织检测具有很高的特异性。两种方法均存在明显的假阴性率，这支持了这些方法的互补性，且数据支持互补检测可缩短报告时间并提高可靶向变异的检出率。 ◊可能影响结果解读的ctDNA检测局限性包括： -肿瘤组分/ctDNA低；某些检测方法包含ctDNA组分的测量，有助于识别ctDNA组分低可能提示敏感性降低的情况 -非靶病灶来源的突变，最常见的是意义未明的克隆性造血（CHIP）或化疗后骨髓克隆。KRAS和TP53突变可在上述情况中均可能出现 -检测方法发现融合及其他相关基因组变异的内在能力 ◊可能影响结果解读的组织检测局限性包括： -样本中肿瘤比例过低，且未通过肿瘤富集或高分析灵敏度方法充分优化 -检测方法发现融合及其他相关基因组变异的内在能力 •胚系检测 ◊若体细胞检测发现致病性/可能致病性变异，且存在分子或临床疑似的胚系易感综合征时，建议转诊至遗传咨询。
•在肺结节数量有限的情况下，应考虑进行检测以区分独立性原发肺癌与肺内转移性疾病。 ▸通过采用MGPT方法检测分别取样的病灶组织以探索肿瘤相关性的研究表明，该方法可能优于组织病理学评估。 ▸显示完全不重叠的独特突变的肿瘤被视为克隆无关的独立性原发肺癌，即使组织学表现相似亦然。共享多个（≥2个）突变的肿瘤更可能具有克隆相关性；然而，这可能取决于单个突变在NSCLC中的普遍程度，以及所识别的变异是驱动变异还是过客变异。未识别出突变或仅识别出一个突变的检测结果对此评估无参考价值。 •靶向治疗进展情况下的检测： ▸对于任何在靶向治疗中出现进展的患者，组织学转化（如小细胞转化）是一种可能的耐药机制。应考虑对进展病灶进行组织活检以评估形态学并进行生物标志物分析。 ▸PET/CT可用于确定疾病进展时最佳的活检靶点。 ▸在进展时，可考虑同时进行ctDNA和基于组织的检测以识别耐药机制。 ▸针对上述多种分析物，有关治疗耐药的分子机制认知正在不断深入。对来自正在接受靶向治疗且出现活跃进展的肿瘤的样本进行再检测，可为下一步适当的治疗提供指导： ◊对于携带潜在EGFR敏感性突变且已接受EGFR TKI治疗的患者，最低限度的适当检测包括： -若患者既往接受过第一/二代EGFR TKI治疗，则需进行p.T790M的高灵敏度评估。用于检测EGFR p.T790M的检测方法应设计为具有至少5%等位基因频率的分析灵敏度。原始敏感性突变可在许多检测方法中用作内部对照，以确定p.T790M（如果作为亚克隆事件存在）是否在检测范围内。p.T790M的存在可指导患者接受第三代EGFR TKI治疗。
-其他耐药机制（如MET和/或ERBB2扩增、基因融合、新驱动突变（旁路信号传导事件）可用于指导患者接受额外治疗。 ◊对于携带潜在ALK基因融合且已接受ALK TKI治疗的患者，识别特定的酪氨酸激酶结构域突变是否能指导下一步适当的治疗尚不明确，尽管一些初步数据表明特定的激酶结构域突变可能影响下一线治疗。 ◊MGPT可能是探索潜在耐药机制最具参考价值的方法，在患者个体化治疗过程中可能需进行多次此类分析。检测方法的选择可能影响在此情况下识别亚克隆事件的能力。
来源：NCCN：非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer） NCCN-NSCLC-2026V6
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